专利名称：利用人工内共生化技术选育羊肚菌优质品种的方法

专利号：ZL 2022 1 0515335.1

授权日：2023年9月26日

羊肚菌(Morchella spp.)属于子囊菌门（Ascomycota），盘菌纲（Pezizomycetes），盘菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellaceae），是国际上公认的珍贵食药兼用真菌。羊肚菌质地柔嫩，风味独特，并具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节和抗肿瘤等多种生理活性。目前我国规模化推广的羊肚菌室外“土壤栽培模式”于2012年首先在我国川渝地区成功应用，并很快推广到全国各地。据不完全统计，2021年我国羊肚菌栽培面积为25万亩左右，遍布全国除海南省以外的其他各省市区。

目前的羊肚菌育种主要依靠常规的自然选育，即从野生或栽培的子囊果出发，通过组织分离、多孢分离或单孢分离获得大量菌丝体分离物，再从中筛选理想的生产菌株。然而，随着羊肚菌人工栽培规模和面积的不断扩大，再加上羊肚菌本身容易老化和退化，自然羊肚菌种植资源日益枯竭等原因，使得优质栽培菌株（品种）的选育速度远远跟不上羊肚菌人工栽培发展的步伐，这也是影响羊肚菌栽培的稳定性，造成菇农损失的重要原因之一。因此，寻求高效育种新技术，促进羊肚菌良种选育，对稳定羊肚菌生产和获取人工栽培理想的经济效益具有显著的现实意义。 

羊肚菌为土生菌，而土壤是微生物的大本营。羊肚菌在生长发育过程中，与土壤中的很多其他微生物发生着非常复杂的生态互作，包括拮抗、竞争和共生等，其中最重要的为共生关系。按照目前人们普遍接受的广义共生概念，共生不仅仅是一对一的互利共生关系，其实是包含互利共生、偏利共生和拮抗/寄生在内的共生连续体。在微生物之间的共生互作中，研究最为深入的是细菌‑真菌互作，即定殖于真菌菌丝细胞质或孢子细胞质内的内生细菌与真菌通过对抗、合作、协同、共栖及共生等类型的互作对彼此的生物学产生重要影响。

近年来，采取组学技术等先进技术手段，表征了羊肚菌生长发育过程中相关微生物群落变化规律，发现了一些可能对羊肚菌生长发育具有促进作用的细菌。例如，Zhang et al. (2019)采用复制子测序技术研究了人工栽培六妹羊肚菌等不同发育阶段的土壤细菌群落多样性，发现在原基分化阶段具有出乎预期高比例的假单胞菌(25.30%)，暗示假单胞菌可能影响羊肚菌生长。Lü et al. (2021) 采用复制子测序检测了尖顶羊肚菌（M. conica）发育子实体的细菌群落动态变化，转录组共表达分析发现细菌群落在调节羊肚菌基因表达中可能发挥重要作用；该研究发现，黄杆菌（Flavobacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）和土地杆菌（Pedobacter）在尖顶羊肚菌子实体的全部发育阶段占优势，暗示其在羊肚菌发育中发挥功能；该研究发现几种内生细菌群落，包括草螺菌、土地杆菌、Arsenicitalea和杜擀氏菌（Duganella）与“细胞壁”和“蛋白酶调节亚基”富集的模块高度相关联，表明细菌群落可能通过调节与细胞壁合成和蛋白酶体相关途径特定酶的表达而促进子实体发育。

我们也采取宏基因组学技术（复制子测序等）进行了土壤微生物群落对羊肚菌生长发育影响的相关研究。我们的研究发现，与羊肚菌发育相关的细菌菌群有副土地杆菌（Parapedobacter）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）等，这些细菌在播种前少量存在，菌丝体阶段大量富集，原基期和收获期种群数量减少，这些细菌可能是由羊肚菌菌丝养殖后期被羊肚菌降解作为营养消耗掉了。短波单胞菌属、土地杆菌属、嗜甲基菌属、鞘氨醇杆菌属、黄杆菌、假单胞菌、马赛菌和草螺菌、杜擀氏菌、氢噬菌属等在原基期大量富集，表明它们可能与促进羊肚菌的原基和子实体发育有关。 

在国外，人工内共生化（artificial endosymbiosis）为合成生物学的范畴，是指涉及建立自然界不存在的理想宿主内共生体关系的试验生物学或合成生物学过程。人工内共生化的终极目标是构建新型生物合成途径，可用于生物燃料生产、食品和农业、发酵工业、生物修复等行业；在新型代谢产物、生物肥料、化学品、酶和其他生物活性分子生产中也具有潜在应用价值；此外，还可用于建立在外空间和其他星球可以存活，或者可以适应地球巨大气候变化条件的新型生命形式。然而，国内外均没有利用人工内共生化技术进行羊肚菌育种的研究和应用报道。

本发明将这些微生物（对羊肚菌人工栽培有益酵母菌和细菌）导入羊肚菌栽培菌株菌丝细胞内部，使双方建立了稳定的内共生关系，研究了外源有益微生物导入对羊肚菌生长发育的影响，建立了人工内共生化技术，发现该技术在选育羊肚菌产量高、抗性强等优质菌株方面具有较大的推广应用潜力。